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Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统
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Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes. 点击查看文献解读详情>>
研究思路:
1.体内外验证DEHP刺激可导致睾丸损伤。
2.组学分析与实验验证得出HIF-1α等信号通路出现异常。
3.探索HIF-1α信号通路的作用机制。
4.体外敲除HIF-1α进一步验证HIF-1α的作用。
严谨的研究,需要完整的实验流程,一般采用组学分析科学地筛选基因、得到多种实验结果需要相互印证。基因敲除依旧是基因功能研究的常规策略之一,一个成功的基因敲除细胞株,对验证结果的准确性至关重要。
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在这项研究中,作者通过MEHP刺激后的表型分析、RNA-Seq分析、ChIP-qPCR 分析等发现与睾丸细胞功能障碍相关的调控基因:HIF-1α。并初步发现其调控机制:MEHP(体内DEHP的主要生物代谢物)可抑制PHDs,影响HIF-1α积累和稳定,导致HIF-1α易位到细胞核,并诱导Leydig和Sertoli细胞中HIF-1/Hmox1结合,使HO-1的表达上调。HO-1的过表达导致亚铁超载,ROS积累,最终导致铁死亡,损伤Leydig和 Sertoli细胞的活性。
为了进一步确认这一结果,研究人员构建了 HIF-1α基因敲除的Leydig和Sertoli细胞系(HIF-1α基因敲除的Leydig和Sertoli细胞系,由赛业生物提供),用于后续的实验。通过Sanger测序和Western blotting检测,确认了敲除细胞系中的HIF-1α被成功敲除。在与野生型细胞相比,HIF-1α-KO的细胞系在MEHP刺激下细胞活力受损的程度有明显改善。同时,脂质过氧化(图1B,I)和亚铁超载(图1C,J)也受到抑制。分别使用qPCR和Western印迹法评估Hmox1和HO-1水平的表达,发现敲除Hif-1α能逆转MEHP刺激下的Hmox1(图1D,K)和HO-1(图1G,N)表达水平上调。
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此外,MEHP刺激后ROS爆发(图1E,L)和细胞死亡(图1F,M)程度也在敲除HIF-1α后减弱。
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Western印迹显示敲除HIF-1α恢复了ACSL4、FTH1和SLC7A11的表达,以及抑制GPX4的表达(图1 G,N)。总的来说,这些结果表明,MEHP刺激以HIF-1α依赖的方式导致睾丸Leydig和Sertoli细胞的铁死亡。
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