牙髓间充质干细胞是什么?怎么分离培养
牙齿是我们最最亲密的老友,几乎陪伴我们一生。它是人体里最坚硬的器官,帮助我们把食物切碎、研磨,在吞咽食物前将食物加工成更适合胃消化的大小和状态,从而让我们更好的吸收食物中的营养,保持健康。虽然它很“强硬”,但也有“脆弱”的一面,由于牙髓内含有丰富的感觉神经末梢,当牙齿遭遇危机时,可能会引起剧烈的疼痛,所以人们常说:“牙疼不是病,疼起来真要命。”
健康从“齿”开始,请呵护牙齿健康,关注牙齿的重要宝藏资源——牙髓干细胞。
牙齿与DPMSCs
牙齿的构造从上到下主要分为牙冠、牙颈、牙根,从外到内主要分为牙釉质、牙本质、牙髓,其中牙髓外部为一层造牙本质细胞,内部还有神经、血管,淋巴和结缔组织,正是因为牙髓组织的这种构造,使我们的牙齿在遭受到外界过冷、过热、外力损伤、压力刺激等不利于身体正常生理活动的情况下,能迅速预警传递给大脑从而发生反应;当牙齿受损时,牙髓内部还存有一种可随时待命的间充质干细胞,他会分化为损伤组织细胞从而修复损伤,或通过分泌多种因子促进伤口愈合降低炎症反应等等。
这种牙髓来源的间充质干细胞在2000年,由Gronthos等科学家发现并分离出来,他与骨髓间充质干细胞有非常相似的表面标记物,及形成矿化结节的能力,科学家根据他的来源命名为牙髓间充质干细胞(Dental Pulp Mesenchymal Stem Cells, DPMSCs)。
我们每个人都有牙齿,牙髓间充质干细胞的来源获取十分便利,没有伦理争议,且他作为间充质干细胞本身的干性和作用也毫不逊色,在牙齿及颌骨组织的再生修复、口腔以外组织的再生修复、免疫调节等多种治疗中具有广阔前景。
人下颌第一磨牙(a–c)和人股骨(d, e)以及牙髓结构(f)之间的对比
DPMSCs分离培养
材料准备
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样本:儿童乳牙或成人智齿,采集时间<12小时,样本保存液:基础培养基+1%双抗10mL,保存温度4℃。
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试剂:OriCell®PBS、OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基、OriCell®Collagenase Type I (0.1%) 一型胶原蛋白酶、OriCell®胰蛋白酶细胞消化液(0.25%)、中性蛋白酶。
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耗材:50mL无菌采集瓶一个、50mL离心管5-10个、10mL移液管4个、T25培养瓶若干个。
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器械:小型手持打磨机、配小齿轮、拔髓针一套(含多种型号)、牙钳、止血钳、眼科剪。
牙髓组织获取
1.1 取儿童乳牙或成年阻生智齿,用小型手持打磨机配灭菌小齿轮在培养皿中纵向或横向将牙冠切掉,用拔髓针取出牙髓组织。
1.2 将取出的牙髓组织放入1.5mL ep管中。用OriCell®PBS润洗培养皿2-3次,收集润洗液,转移进1.5mL ep管中。
牙髓组织消化
2.1 用眼科剪适当剪碎牙髓组织,消化液配制终浓度为胶原酶Ⅰ型(3mg/mL):中性蛋白酶(4mg/mL)=1:1;使用1-2倍体积的消化液与牙髓组织混匀,置于摇床37℃消化1小时。
2.2 轻轻吹打组织块,使细胞离散成单个细胞悬液。OriCell®PBS洗涤1-2遍,挑出没有消化掉的组织放入T25培养瓶底部贴壁静置,细胞悬液室温250×g,6min离心,去上清。
2.3 用OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基3mL重悬细胞,轻轻接种于装有牙髓组织块的T25培养瓶中,尽量不要使已贴壁的组织块漂浮起来,将培养瓶放入培养箱中37℃,5%CO2条件培养。24h后观察细胞,看细胞是否有贴壁和污染现象。
换液操作
2.4. 原代接种第3天进行第一次半量换液。
2.5. 轻轻将培养瓶中的培养基倒入50mL离心管中,250×g,6min离心。
2.6. T25培养瓶中加入离心完毕的1.5mL旧培养基,1.5mL新OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基,半量换液完毕。
2.7. 将培养瓶放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。
2.8. 完成第一次换液后每隔3天进行一次半量换液(可以根据生长情况适当调整),半换液直到细胞汇合度达到可传代为止。
传代培养
(P0传P1与P1后传代的操作方法流程一致)
2.9. 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。
3.0. 吸去培养容器中的培养基。用OriCell®PBS(T25培养瓶加入约3mL,T25培养瓶加入约3mL)洗涤细胞2次,注意动作轻柔,清洗全面。吸去PBS。
3.1. 加入OriCell®胰酶(T25培养瓶加入约1.5 mL,T75培养瓶加入约3mL),迅速铺匀,保证充分接触细胞表面。
3.2. 显微镜下观察消化情况,约70%~80%细胞收缩变圆后,轻拍培养容器外壁,使细胞脱离培养表面。立即加入OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基(T25培养瓶加入约3mL,T75培养瓶加入约6mL),随即轻摇培养容器,使培养基和胰酶迅速混匀,终止消化。
3.3. 使用吸管或移液管吸取细胞悬液,吹打培养容器底面数次,尽可能将细胞都吹打下来。
注意:吹打动作不可剧烈,避免产生大量气泡,否则可能损伤和损失细胞。
3.4. 将细胞悬液转移至离心管中。用OriCell®PBS(T25培养瓶加入约3mL,T75培养瓶加入约6mL)洗涤容器1次,收集残留细胞。
3.5. 收集的所有细胞悬液以250×g,离心4min。
3.6. 离心后去除上清。加入2mL OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基,轻柔吹打细胞沉淀,充分吹散、混匀。将细胞按(2.5~4)×104个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。
注意:培养牙髓间充质干细胞对于细胞密度有较高的要求,我们建议有条件且计数效率较高的情况下,进行手工计数,以期获得精准的细胞浓度指导接种;在没有精确计数条件的情况下,按照适宜比例传代是更好的方法。通常牙髓间充质干细胞传代比例为1:3,72h内生长至可传代汇合度。请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
3.7. 摇匀细胞,放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。
3.8. 传代次日,观察细胞状态。若发现较多漂浮细胞,应予以换液。待细胞生长至90%汇合,即需传代或冻存。
注意:正常情况下牙髓间充质干细胞每代生长时间不超过72h,中途不需要换液,频繁换液会破坏构建起的细胞微环境。
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