• 样本：包含真皮层的皮肤组织，面积≥5mm²，采集时间＜12小时。样本保存液：基础培养基+1%双抗10mL，保存温度4℃。

• 试剂：OriCell^®PBS 100mL、OriCell^®人成纤维细胞完全培养基50mL、OriCell^®Collagenase Type I (0.1%)一型胶原蛋白酶。

• 耗材：50mL无菌采集瓶一个、50mL离心管5-10个、10mL移液管4个、T25及T75培养瓶若干个。

• 器械：止血钳、眼科镊、眼科剪。

1.1 从采集瓶中取出皮肤组织，放入装有20mL含双抗和PBS的50mL离心管中，反复清洗3min以充分洗涤皮肤组织，直到清除皮肤组织残留的杂质及血液。

1.2 转移至装有20mL 75%酒精离心管中消毒40秒，再用PBS冲洗两次。

1.3 一型胶原蛋白酶消化：加入等体积新配制的预热（提前半小时于37℃的CO₂培养箱预热）的一型胶原蛋白酶溶液，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5~10秒，置于4℃冰箱，消化过夜。

1.4 第二天取出，剥掉表皮及脂肪组织，充分剪碎。

1.5 一型胶原蛋白酶消化：加入等体积新配制的预热（提前半小时于37℃的CO₂培养箱预热）的一型胶原蛋白酶溶液，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5~10秒，置于气浴摇床中，37℃，150rpm，消化90min。

1.6 加入2mL完全培养基，终止消化，PBS定容至90mL，分装至2支50mL离心管中，250×g，6min离心。

1.7 弃上清，培养基重悬后合并至一管，PBS定容至45mL，250×g，6min离心。

1.8 10mL PBS重悬细胞，吹散，将消化后的组织用100μm细胞滤网过滤后分装到两个50mL的离心管中，PBS定容至30mL，从滤网夹取少量组织均匀铺平放入待接种细胞的T25培养瓶底。

1.9 室温250×g，6min离心。

1.10 吸去上清液，不能直接倒掉。

1.11 加入10mL PBS重悬细胞，250×g，6min离心。

1.12 离心后去上清，加3mL完全培养基重悬细胞。

1.13 将细胞悬液接种到1个T25培养瓶中。

1.14 将培养瓶水平放入37ºC, 5% CO₂培养箱中培养。

1.15 24h后观察细胞，看细胞是否有贴壁或污染现象。

2.1 原代接种第3天进行第一次半量换液。

2.2 轻轻将培养瓶中的培养基倒入50mL离心管中，250×g，6min离心。

2.3 向T25培养瓶中加入离心完毕的1.5mL旧培养基，加入1.5mL新完全培养基，半量换液完毕。

2.4 将培养瓶放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中。

2.5 完成第一次换液后每隔3天进行一次半量换液(可以根据生长情况适当调整)，半换液直到细胞生长至90%汇合即需传代。

（P0传P1与P1后传代的操作方法流程一致）

3.1 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。

3.2 吸去培养容器中的培养基。用PBS(T25培养瓶加入约3mL，T25培养瓶加入约3mL)洗涤细胞2次注意动作轻柔，清洗全面。吸去PBS。

3.3 加入胰酶(T25培养瓶加入约1.5 mL，T75培养瓶加入约3mL)，迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。

3.4 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。立即加入完全培养基(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)，随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

3.5 使用吸管或移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。

3.6 将细胞悬液转移至离心管中。用PBS(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约 6mL)洗涤容器1次，收集残留细胞。

3.7 收集的所有细胞悬液以250×g，离心4min。

3.8 离心后去除上清。加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

3.9 将细胞按(2.5~4)×10⁴个活细胞/cm²接种至适宜的培养容器内。

3.10 摇匀细胞，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中。

3.11 传代次日，观察细胞状态。若发现较多漂浮细胞，应予以换液。待细胞生长至 90%汇合，即需传代或冻存。