牙髓间充质干细胞提取方法是否适用于所有类型的牙齿?
牙髓间充质干细胞(dental pulp mesenchymal stem cells,DPMSCs)属于被定义较晚的一种间充质干细胞类型,它从健康成人第三磨牙中发现,从此改变了脱落牙齿和拔除智齿作为口腔医疗废弃物的固定标签,并成为MSCs研究的主要来源,变废为宝。
DPMSCs是一种具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞,具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点,在再生医学领域取得了很大进展,具有广阔的应用前景。
国内首个申报牙髓间充质干细胞的注射液的新药临床实验在2020年8月获得临床默示许可,并在今年5月顺利进入II期临床[2]。该注射液的有效成分是人牙髓间充质干细胞,临床用于治疗慢性牙周炎。
应用前景如此广泛,取料获取也不难的
牙髓间充质干细胞
应该如何获得呢?
此前我们已经为大家介绍了一种取材方法
请随我们往下看,
还有另两条罗马大道~
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组织样本: 无龋齿的健康智齿或自然脱落的乳牙。
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实验试剂:OriCell®PBS缓冲液(1X), OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基, OriCell®胰蛋白酶细胞消化液(0.25%),OriCell®I型胶原蛋白酶(0.1%) ,OriCell®青霉素-链霉素溶液(100X)。
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器具耗材:细胞培养皿,眼科镊,牙科钳,牙科锤。
- 离体牙应置于冰上运送至实验室,并于12h内提取牙髓组织。
- 使用含有2%的双抗的PBS冲洗离体牙2次,每次1min。如果有龋齿,置于75%乙醇中浸泡2-3min后再冲洗。
- 冲洗完成的离体牙置于装有含2%双抗的PBS培养皿中,PBS需完全没过牙齿,用镊子刮去离体牙上的其他组织和杂质。
- 杂质完全去除后,转移至新的培养皿中,用牙科锤和牙科钳将牙体分离,暴露牙髓腔。
- 将碎牙转移至新的培养皿,用眼科镊将牙髓剥离并置于无菌PBS中。
牙髓间充质干细胞的获得
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用眼科镊将牙髓撕成丝状,在培养皿内均匀铺开,并自然晾干3-5min。
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在这期间将OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基预热至37℃。
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待牙髓紧贴皿壁后,沿皿壁轻柔加入OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基,放入在 37℃、 5%CO2、 95%相对湿度的培养箱中进行培养。
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培养的前72h尽量不要挪动培养皿,72h后镜下观察细胞迁出情况,视情况进行换液,待细胞汇集率达到80%-90%,即可进行传代。
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将0.1%的I型胶原酶预热至37℃。
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将牙髓组织剪碎至1mm2大小,利用离心管收集牙髓组织,常温条件下265g离心力,离心5min。
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弃上清,使用5mL的0.1% I型胶原酶重悬牙髓组织,置于37℃水浴中消化20min,期间每5min取出充分摇匀,或者有条件可以使用恒温摇床进行消化。
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消化完成后加入等体积的完全培养基,完全混匀消化悬液和完全培养基。
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265g离心5min,弃上清,使用预热的OriCell®人牙髓间充质干细胞完全培养基重悬细胞,接种至培养皿中。
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接种完成后尽量不要移动培养皿,72h后观察细胞状态,之后视情况进行换液,待细胞汇集率达80%-90%,即可进行传代。
直接贴壁或者胰酶消化法均可获得牙髓间充质干细胞,但是如果使用的实验材料是乳牙,建议使用直接贴壁法,以增加细胞得率。因为乳牙牙髓非常脆弱及松软,且组织较小,使用贴壁法可以尽量减少操作时间,避免步骤过多,牙髓组织有额外损失。
牙髓间充质干细胞的传代
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将完全培养基、0.25%胰酶预热至37℃。
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吸去培养液,用1×PBS洗涤细胞2-3次以去除残留的血清,吸去PBS。
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加入适量0.25%胰酶,轻轻旋转培养皿,使胰酶覆盖细胞表面,消化1-2min,显微镜下可见细胞间隙增大、 变圆(以显微镜下所见为消化依据)。用手轻拍培养器皿的壁,当大约有80%细胞脱壁浮起时,立即加入2-3mL完全培养液终止消化。
注意:总的消化时间不可太长。因为对于间充质干细胞来说,其消化脱壁的时间应该较短,难以消化脱壁的细胞可能多数不是间充质干细胞,而是其他的杂细胞。
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将细胞移入离心管中,再向培养瓶中加入1×PBS洗1-2次,同样转移至离心管中。
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265g离心4min,吸去上清液后用2-3mL完全培养基重悬细胞。
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按照细胞量或按照2×104个细胞/cm2的密度接种细胞。
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加入完全培养基,在 37℃、5%CO2、95%相对湿度的培养箱中进行培养。
以上就是人牙髓间充质干细胞的提取和传代方案啦,大家都学会了吗?
OriCell®牙髓间充质干细胞完整解决方案
作为已经有17年干细胞培养经验的专家,赛业OriCell®可提供DPMSCs完整解决方案:
产品类型 |
热门产品 |
货号 |
原代细胞 |
人牙髓间充质干细胞 |
HUXDP-01001 |
细胞培养 |
人牙髓间充质干细胞完全培养基 |
HUXDP-90011 |
HUXDP-80011 |
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人牙髓间充质干细胞完全培养基(无血清II型) |
HUXDP-90062 |
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人牙髓间充质干细胞去外泌体完全培养基 |
HUXDP-90012 |
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优级胎牛血清 |
FBSSR-01021 |
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诱导分化 |
人相关干细胞成骨诱导分化试剂盒 |
HUXXC-90021 |
人相关干细胞成脂诱导分化试剂盒 |
HUXXC-90031 |
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人相关干细胞成软骨诱导分化试剂盒 |
HUXXC-90041 |
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消化冻存 |
通用无蛋白非程序冻存液 |
NCPF-10001 |
PBS缓冲液(1X) |
PBS-10001 |
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胰蛋白酶细胞消化液(0.25%) |
TEDTA-10001 |
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细胞鉴定 |
间充质干细胞(人)表面标记检测试剂盒 |
HUXMX-09011 |
此外,针对骨髓、脂肪、脐带、脐血来源的间充质干细胞,赛业OriCell®亦提供完整解决方案,如有需要,欢迎联系我们咨询订购。
参考文献
1. GRONTHOS S,MANKANI M,BRAHIM J,et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and invivo.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(25):13625-13630.
2. 中源协和细胞基因工程股份有限公司关于参股子公司药物进入Ⅱ期临床试验的公告(公告编号:2023-022,2023年5月25日)。
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