间充质干细胞培养有哪三大难题?

随着新学期的启动，不少小伙伴已经重返实验室劳作搬砖了。额~还有各种细胞培养问题接踵而至......

赛业OriCell^®已为大家整理好了，间充质干细胞(MSC)培养的三大热门问题超级实用帖➡答疑解问、顺畅通关

1.细胞半贴壁/漂浮

间充质干细胞在常规培养条件下，均为贴壁生长状态。而刚提取的间充质干细胞在培养过程中非常容易出现细胞漂浮的情况。

盘点间充质干细胞培养

图源自客户咨询，仅用于学习、交流。

导致这个问题的原因也有很多，下面就来，逐一排查，对症施策。

❌错误选择培养器皿，材料表面吸附能力较弱。

⭕使用TC处理的培养器皿可以促进细胞贴壁附着。

❌细胞本身贴壁能力较弱。

⭕可以使用明胶，PLL，血清等预先包被培养皿，增强吸附性。

❌培养条件不适合。

⭕间充质干细胞对培养基和血清的要求较高，应该经过预实验确定适宜的培养体系。

❌细胞处理操作不当。

⭕

▶ 使用的试剂提前预热，减少细胞遇冷的情况；

▶ 胰酶消化时间不可过长；

▶ 不可过度机械吹打。

2.细胞传代后不贴壁/漂浮

养的时候好好的，一传代细胞就漂给我看~

那快看看，你是不是不小心做了这些错误操作：

❌胰酶消化时间过长，细胞长时间暴露于胰酶中，细胞失去胞内稳定性。

⭕

▶缩短胰酶消化的时间，以显微镜下观察到细胞变圆为止作为终止消化的标准；

▶降低胰酶使用浓度，可考虑使用0.1%的胰酶进行消化。

❌过度吹打，给细胞带来机械损伤。

⭕吹打细胞的过程太长或者用力过度，会带来细胞承受不了的剪切力和挤压力等机械应力，应该减少吹打次数和时间，吹打至肉眼无可见细胞团即可。

❌传代密度过小或者过大，细胞无法正常贴壁。

⭕选择适宜的密度传代，一般推荐1:2或者1:3的比例进行传代；按2.5～4万个活细胞/cm²接种。

❌培养条件不适宜。

⭕

▶预实验选择适合的培养体系，间充质干细胞对血清、培养基的要求与普通细胞系有差别，并不可简单的通用基础培养基；

▶可额外补充生长因子，以保持干细胞的最佳生长状态。

3.细胞生长慢

首先，要明确的是「原代细胞本身的生长速度肯定是低于细胞系的」。

但是，如果发现您的细胞的生长时间远低于文献报道的倍增时间，

那就应该考虑是否是以下问题导致的：

❌细胞接种初始浓度过低！

⭕增加接种细胞的起始浓度。

❌培养液配置/保存不当。

⭕完全培养基配置时注意各组分保存温度及性状是否正常，无异常再进行配置；配置完成的完全培养基要注意保存条件，置于4℃冰箱中保存，尽快用完，不要长时间放置。

❌支原体污染。

⭕支原体污染的培养基不会有异常表现，但是被支原体污染的细胞会导致生长速度变缓。此时可以使用专业的支原体清除试剂，使用1-2周后，检测清除效果。

❌细胞老化/分化。

⭕若细胞呈现扁平状，胞浆内特别是在核区附近出现黑色颗粒、立体感消失、间隔不清、细胞的形状趋向多样、死细胞增多等情况，建议重新提取细胞。

盘点间充质干细胞培养

细胞老化表现

❌更换了培养基或者血清。

⭕在确定新的培养基和血清能够完全达到之前使用的培养效果之前，不可直接更换新的培养体系。建议比较新培养基与旧培养基的成分是否一致，新血清与旧血清对细胞生长的支持作用是否一致，确定无异常再进行更换。

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