胰（Pancreas）是人体的第二大消化腺，横跨在第1、2腰椎的前面，质地柔软，呈灰红色，可分为头、体、尾三部。胰腺是人体最重要的器官之一，因为它兼有内、外分泌的功能。外分泌部的腺细胞分泌胰液，经各级导管，流入胰腺管，胰腺管与胆总管共同开口于十二指肠。内分泌部是指散在于外分泌部之间的细胞团——胰岛，它分泌的激素直接进入血液和淋巴，主要参与糖代谢的调节。

图1. 胰腺外观图

胰腺表面覆以薄层结缔组织被膜，结缔组织伸入腺内将实质分隔为许多小叶，但人胰腺小叶分界不明显。腺实质由外分泌部和内分泌部两部分组成。外分泌部为浆液性复管泡状腺。小叶间结缔组织中有导管、血管、淋巴管和神经。胰岛（pancreas islet）是由内分泌细胞组成的细胞团，分布于腺泡之间。人胰岛主要有A（约20%）、B（约70%）、D（约50%）、PP（较少）四种细胞，某些动物的胰岛内还有D1细胞、C细胞等，细胞之间有紧密连接和缝隙连接。

图2. 胰腺解剖横断面模型

腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科（parvoviridae），病毒颗粒无包膜，结构为直径约20nm的正二十面体，是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。重组腺相关病毒（Recombination adeno-associated virus，rAAV）载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。

1.血清型的选择

Quirin K A等人^[2]通过静脉给药对比了scAAV9和scAAV8对于胰腺的侵染能力，发现scAAV9＞scAAV8，在病毒注射量为1E+12 vg时，scAAV9能够侵染45%的胰腺细胞（图4）。随后他们通过逆行胰管给药，对比了scAAV6，scAAV8和scAAV9对于胰腺的侵染能力。结果表明这种给药方式下，scAAV6对于胰腺的侵染能力最高，能够侵染80%的胰腺细胞，可以有效转染胰腺的腺泡细胞、上皮细胞和间质细胞（图5）。

图4. AAV8和AAV9通过全身递送靶向胰腺的比较^[2]

图5. 逆行胰管给药不同血清型对胰腺的侵染情况^[2]

常规血清型想要对胰腺有较好的侵染效果，通常要使用逆行胰管给药（图6A），这种给药方式创伤较大，难度较高。Chen M等人^[3]使用衣壳优化的AAV8载体，采用尾静脉和腹腔注射的方式研究AAV在胰腺和胰腺肿瘤中的表达。研究人员生成了三种不同的酪氨酸-苯丙氨酸(Y-to-F)突变AAV8载体，并将它们的转导效率与野生型AAV8在小鼠模型中的正常胰腺和胰腺导管腺癌(PDAC)进行了比较。他们发现，双突变AAV8(Y447F+Y733F)在胰腺组织中表现出最高的转导效率，与野生型AAV8的7%相比，双突变AAV8(Y447F+Y733F)的mCherry表达达到45-70%。与野生型相比，该双突变体在正常胰腺中的载体基因拷贝数也高出7倍，在PDAC中的转导效率高出15倍。双突变AAV8(Y447F+Y733F)通过腹腔注射可以显著增强在胰腺中的基因表达，相比于尾静脉注射，腹腔注射可以使mCherry表达效率提高4.28-9.6倍。

图6. Y447F+Y733F-AAV8双突变体提高小鼠胰腺的转导效率^[3]

^{2.特异性启动子}

为了实现目的基因在胰腺中特异性性表达，除了选择感染胰腺效果较好的血清型，配合使用胰腺特异性表达启动子也是非常重要的一步，特异性启动子可以避免目的基因在非靶细胞中大量表达。

下面我们就看一下胰腺常用的特异性启动子有哪些。

Guo P等人^[4]的研究使用α细胞特异性的glucagon (GCG)启动子来驱动Pdx1和MafA转录因子在胰腺α细胞中的表达。AAV8-GCG-Pdx1-MafA载体能够特异性地靶向并转导胰腺α细胞，导致这些细胞中Pdx1和MafA的表达。在胰腺导管注射AAV8-GCG-PM病毒10天后，观察到超过96%的胰腺α细胞表达GFP。

表1. glucagon (GCG)启动子应用信息^[4]

Ins1，RIP胰岛β细胞特异性启动子

Ramzy A等人^[5]使用AAV8-Ins1-Cre提供了一种有效的替代性转基因Cre驱动小鼠系统，避免了发育缺陷、β细胞功能受损和高成本等问题。研究人员对腹腔注射AAV8 Ins1-Cre小鼠的胰腺进行免疫染色，检测胰岛素和绿色荧光蛋白。3E+12 vg组3/3小鼠和1E+12 vg组2/3小鼠的β细胞重组率较高(81-93%)（图7）。

图7. 腹腔注射不同量的AAV对胰岛β细胞的侵染效率^[5]

在Wang J ^[6]等人研究中，研究人员通过腺相关病毒载体(AAV8-RIP2-Nr3c1-3×Flag)将NR3C1基因导入小鼠胰腺，从而利用RIP2启动子在β细胞中特异性过表达NR3C1。这种β细胞特异性的NR3C1过表达小鼠模型可用于研究NR3C1在糖尿病发病机制中的作用。

Xiangwei Xiao等人^[7]的研究表明携带Sox9启动子的AAV可以特异性地感染胰腺导管细胞。研究中使用携带Sox9启动子驱动的Cre重组酶的AAV6载体可以特异性地标记胰腺导管细胞。使用携带Sox9启动子驱动的VEGF shRNA的AAV6载体可以特异性地敲低胰腺导管细胞中VEGF的表达。总之，Sox9启动子可以用于靶向胰腺导管细胞，实现对该细胞群的基因操作和标记。

表2. Sox9启动子应用信息^[7]

3.注射方式

相比于肾脏多种给药方式，胰脏的给药方式主要就3种：尾静脉给药、腹部给药和胰腺导管给药。下面我们就以表格的方式，对比一下3种给药方式（表3）。在侵染效率上，胰腺导管给药>腹部给药>尾静脉给药。前期的应用中研究人员多数选择了胰腺导管给药，但是胰腺导管给药（图8）创伤大，难度高，腹腔注射配合衣壳优化后的血清型AAV8(Y447F+Y733F)，也能取得对胰腺较高的感染效率^[3]。

表3. 胰腺不同的注射方式