间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，来源于中胚层，它们在多种组织中广泛存在，如骨髓、脐带、脂肪、牙髓、胎盘等。

间充质干细胞的培养和纯化是一个需要细致操作和严格控制的过程。从培养条件的准备到细胞的传代，再到纯化和质量检测，每一个环节都可能影响最终的细胞质量和实验结果。

MSC培养条件

1. 培养基的选择 

根据细胞来源的不同，需要选择不同的基础培养基（例如：DMEM，α-MEM等），同时添加10%胎牛血清（FBS），以及相应的生长添加物（例如：L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，NEAA等）。

【划重点】间充质干细胞的原代培养条件严格，对使用的血清和添加物都非常敏感，并非单纯的基础培养基加常规血清所能替代。影响间充质干细胞的生长的关键成分是「胎牛血清」，为了不影响细胞的生长，建议使用高质量的胎牛血清，或者选择相应的商品化完全培养基。

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2. 传代时机 

当细胞达到80-90%的汇合度时，进行1:3比例传代3~4×104 cells/cm²。过早传代（或传代次数太频繁），会由于细胞密度不足导致干细胞的极性逐渐丧失，影响后续实验；传代过晚则可能引起接触抑制，使细胞进入平台衰退期，传代后分化老化严重，产生较多细胞碎片，影响细胞生长。

错误案例展示：MSC传代太密

细胞密度高，消化不充分，细胞聚团。长“过头”，细胞进入平台衰退期，“拉丝"，细胞碎片增多。

3. 消化时间 

胰蛋白酶是常用的消化酶（也有不用胰酶，只用EDTA，或者胰酶/EDTA联合作用），但消化时间需要严格控制，使用0.25%胰蛋白酶消化1min。时间过长会损伤细胞膜，影响细胞活性。

错误案例展示：胰酶消化时间过长

胰酶消化时间久，细胞扁平，“拉丝”，失去极性。

4. 纯化细胞

间充质干细胞亦属于原代细胞，任何原代细胞刚提取出来（P0），纯度都不可能是100%，即使不断纯化也只能做到无限趋近完美。

常见的纯化方法：

• 完全培养基分选：使用完全培养基进行细胞纯化是一种常见的方法，其核心在于通过优化培养基成分和培养条件，选择性地促进目标细胞的生长，同时抑制其他细胞的生长。

• 磁珠分选：使用CD44、CD90、CD105等标志物的抗体偶联磁珠，通过磁力分离纯化间充质干细胞。这种方法高效，但需要确保磁珠的质量和抗体的特异性，避免非特异性结合或丢失目标细胞。

• 流式细胞术分选：可以更精确地分选特定表型的细胞，但操作相对复杂，需要专业的设备和技能。成本也较高，适合需要高纯度细胞的情况。

• 酶消化法：通过特定酶消化去除不需要的细胞，比如用胶原酶消化结缔组织细胞，但这种方法可能会影响间充质干细胞的活性，需要谨慎操作。

5. 质量控制与检测 

• 表型检测：通过流式细胞术检测细胞表面标志物，如CD44、CD90、CD105阳性，而CD34、CD45阴性，确保细胞纯度。这一步需要掌握流式细胞术的操作方法和数据分析。

Yuhan J et.al. Int. J. Mol. Sci. 2019

• 多向分化潜能检测：通过诱导分化为成骨、成软骨、成脂肪细胞，验证细胞的分化能力。

同时满足下列4个要点才能进行分化潜能检测：① 细胞形态正确，呈现典型的成纤维状；② 无细菌，真菌，支原体污染；③ 表达MSC表面标志物；④ 良好的增殖及体外培养能力。