高能预警  马上开始

干细胞在诱导前的状态、密度和纯度是诱导成骨成功与否的关键因素。干细胞在诱导前状态不好，密度低于70%，纯度不够都有可能使得诱导不成功。

建议：

✅ 使用状态良好的，代次较早的细胞来进行成骨诱导。

✅ 可适当延长换液时间，3天换液一次改成4天换液一次。

✅ 适当延长诱导时间。

干细胞在成骨诱导过程中还会继续增殖，当细胞增殖到一定程度的时候，单层贴壁细胞就会变得容易回缩脱落。

故在成骨诱导前，一般建议使用0.1%明胶对耗材表面处理30min，吸掉明胶后晾干方可接种细胞。当细胞达到70%汇合度时可换成骨诱导液开始进行诱导。

✅ 细胞包被：诱导之前包被明胶（0.1%的明胶溶液），以防止成骨诱导后期细胞出现成片脱落的现象。    

✅ 诱导起始点：细胞汇合度达到65%-70%时开始换用诱导液。

✅ 分化诱导：诱导2-3天进行换液时动作需轻柔，液体沿6孔板壁加入，防止已形成的钙结节被冲刷掉；建议看到明显钙结节的情况下再染色，不要着急染色。

✅ 细胞固定：时间为30min，不宜太长。

✅ 茜素红染色：时间控制在5min左右，如果染色效果较浅可以适当延长时间。 

染不上色的原因：

❎ 很有可能是诱导没有成功，看不到明显的脂滴或者看到的是细胞空泡。

❎ 若看到明显的脂滴但是染不上色，有可能是染色液失效。

染色很浅的原因：

❎ 染色液失效。

❎ 染色液稀释的比例不对。

一般油红O染液产品在2~8℃冰箱保存，染色前按油红O染液：蒸馏水=3:2的比例稀释使用（染色前现配现用），稀释后会有明显沉淀出现。为了更好的实验效果，需要用滤纸过滤或者用离心（250×g，4min）的方法去掉沉淀。

干细胞诱导前的状态和纯度对诱导的成功与否至关重要。若干细胞诱导前的状态很差，则诱导不一定成功；若干细胞诱导前纯度不高，则诱导的阳性率会很低，甚至为零。

此时，一般建议：

✅ 重新诱导，选择代次较早，状态较好，纯度较高的细胞诱导。

✅ 诱导时间可相对延长；或诱导周期从“A液诱导3天，B液维持1天”改成“A液诱导4天，B液维持1天”。

▶ 若配套组分加入前未充分溶解，加入后即产生沉淀，建议客户在混合前先水浴溶解，待充分溶解后再混合。

▶ 培养基出现的沉淀物也可能是血清融解过程中所释出的蛋白，属于正常现象。

✅ 高倍镜下观察，选择脂滴大且美观的视野拍照。

✅ 赛业OriCell^®提供的油红O染液按比例稀释后，滤纸过滤或者离心取上清染色可有效减少“渣渣”。

✅ 诱导起始点：细胞汇合度达到100%时开始换用诱导液A液。

✅ 分化诱导：通常情况下是“A液诱导3天，B液维持1天”进行循环诱导。实际操作过程中可以根据细胞状态适当增加或者缩短A液诱导的时间。

✅ 油红O染色：换液动作需轻柔， 最后染色时油红O染液和蒸馏水需要按照3:2比例进行稀释并用中性滤纸过滤之后方可使用。

✅ 诱导液准备：赛业OriCell^®提供的成软骨诱导液是无血清培养体系，需要在15mL的锥形底离心管中进行诱导。

✅ 细胞密度：诱导终浓度为2.5×10⁵/500µL。

✅ 分化诱导：细胞加入诱导液之后24h之内不要摇动离心管，首次弹起细胞的时间一般是24-48h；之后每两天进行一次换液，每次换液之前需要将细胞团弹起以便与诱导液充分接触；

✅ 诱导评估：细胞团直径增至2mm左右时终止诱导，进行后续的石蜡切片以及阿利新蓝染色鉴定。