皮肤为人体最大的器官，成纤维细胞是皮肤真皮层中主要细胞，而且是人体最容易获得的体细胞。人皮肤成纤维细胞不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的皮肤。因此，已广泛应用于抗皮肤衰老、整形外科、组织工程皮肤等领域。

下面介绍人成纤维细胞的原代培养方法

材料准备

OriCell®人成纤维细胞（货号HXXFB-00001）

OriCell®人成纤维细胞完全培养基（货号HXXFB-90011，套装内含基础培养基、优级胎牛血清和培养添加物）

实验步骤

• 水浴锅37℃预热。完全培养基温浴到37℃。在15mL离心管中加入5mL以上完全培养基备用。
• 从-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。注意融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化迅速、均匀；且晃动时应避免水没过管盖造成污染；管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，即停止水浴。继续晃动冻存管，至冰晶融化。
• 用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。
• 在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的离心管中。
• 用1mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞，减少损失。
• 细胞悬液以250×g，离心4min。
• 离心后去除上清。加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
• 将细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。
• 摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。注意接种2h内不可移动、观察细胞。这会严重影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。
• 复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。
• 之后，每2天更换一次完全培养基，直到细胞生长至90%汇合，即需传代。通常OriCell®人成纤维细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。请根据细胞实际生长情况调整传代比例。

小TIPS

培养人成纤维细胞对于细胞密度有较高的要求，我们建议有条件且计数效率较高的情况下，进行手工计数，以期获得精准的细胞浓度指导接种；在没有精确计数条件的情况下，按照适宜比例传代是更好的方法。

正常情况下OriCell®人成纤维细胞每代生长时间不超过72h，中途不需要换液。频繁换液会破坏构建起的细胞微环境。